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    傷口愈合/細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)新方法-如何劃出筆直均一的劃痕

    更新時(shí)間:2018-06-28   點(diǎn)擊次數(shù):4811次

    前言
         傷口愈合實(shí)驗(yàn)是體外研究細(xì)胞遷移的一個(gè)有用的實(shí)驗(yàn)。原理是人為的在鋪板的單層細(xì)胞中制造一個(gè)空白的無(wú)細(xì)胞的地帶,然后對(duì)這個(gè)無(wú)細(xì)胞地帶的邊緣的細(xì)胞進(jìn)行觀察;這些邊緣的細(xì)胞會(huì)開(kāi)始進(jìn)行遷移活動(dòng),并且zui終覆蓋整個(gè)無(wú)細(xì)胞的區(qū)域,重新互相接觸在一起。
     
     
    傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法
         細(xì)胞在培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁后,使用移液槍的槍頭在貼壁細(xì)胞的中間劃過(guò),人為造成一道傷口(劃痕),之后定時(shí)測(cè)量劃痕的寬度,進(jìn)而得到傷口愈合的細(xì)胞遷移數(shù)據(jù)。
     
    實(shí)驗(yàn)缺點(diǎn):
    1.手動(dòng)劃痕,不能保證每次劃痕的一致;
    2.有時(shí)候在劃細(xì)胞的同時(shí)會(huì)刮壞一片細(xì)胞,對(duì)劃痕的邊緣的細(xì)胞造成機(jī)械損傷;
    3.如果培養(yǎng)皿底部還有包被蛋白的話,槍頭劃過(guò),很可能傷害到包被,進(jìn)而影響到細(xì)胞遷移,結(jié)果便很難判斷是哪個(gè)因素造成了決定性的影響。
    4.定時(shí)測(cè)量劃痕的寬度,計(jì)算劃痕寬度隨時(shí)間推移的變化;在選取劃痕測(cè)量點(diǎn)時(shí),不可避免地引入了主觀誤差(人為選取了遷移結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期的點(diǎn));
     
           綜上,傳統(tǒng)的傷口愈合方法總是重復(fù)性不佳,對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的闡述說(shuō)服力不足。
           下面分享一種新方法,輕松得到筆直均一的劃痕!
     
    實(shí)驗(yàn)核心
           使用傷口愈合插件制造筆直均一的劃痕(圖一)。

    實(shí)驗(yàn)方法     
    一.實(shí)驗(yàn)材料
    1) 細(xì)胞:     MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ: ACC115)
    2) 實(shí)驗(yàn)耗材:   ibidi 35 mm培養(yǎng)皿帶傷口愈合插件(ibidi, 81176) ibiTreat
    3) 細(xì)胞培養(yǎng)基:  RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)
    4) 細(xì)胞消化試劑:  Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)
    5) 滅菌鑷子
    6) 倒置顯微鏡,如果需要進(jìn)行連續(xù)的觀測(cè)搭配鏡載加熱孵育系統(tǒng)
     
    一.實(shí)驗(yàn)步驟
    1.鋪細(xì)胞(圖二)
    為了獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在做實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行一次預(yù)實(shí)驗(yàn),以確定需要使用的細(xì)胞懸液的密度。我們建議,將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為24小時(shí)后正好可以長(zhǎng)滿每個(gè)插件的小孔。
    ● 將ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶撕除。
    ● 準(zhǔn)備細(xì)胞懸液,調(diào)整懸液濃度為3*105 cells/ml,這樣24小時(shí)后,細(xì)胞能剛剛長(zhǎng)滿單個(gè)小孔。
    ● 在ibidi細(xì)胞插件的每孔中加入70μl的細(xì)胞懸液。注意不要大力晃動(dòng)培養(yǎng)皿。以防止細(xì)胞不均勻。
    ● 在37。C培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。

    圖二:A. 去除培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶。B.C.在ibidi傷口愈合插件中加入細(xì)胞。
     
    1.形成“劃痕”
    當(dāng)所有細(xì)胞都貼壁并且剛剛長(zhǎng)滿的時(shí)候,就可以開(kāi)始傷口愈合實(shí)驗(yàn)了。用鑷子將傷口愈合插件提出,之后加入新鮮的培養(yǎng)基,或者在培養(yǎng)基中加入刺激劑,然后觀察傷口愈合的情況。
    ● 24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞前一天種的細(xì)胞做鏡檢。細(xì)胞要貼壁并且是剛剛長(zhǎng)滿每個(gè)孔。長(zhǎng)得過(guò)多移除插件時(shí)會(huì)帶走很多細(xì)胞,長(zhǎng)得過(guò)少,傷口愈合的效果很差。
    ● 如圖三所示,小心的用鑷子夾住插件的一個(gè)角,將插件移除。 

    圖三:用鑷子移除插件
    ● 移除插件后,要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”(圖四)。
    ● 小心的清洗細(xì)胞,之后加入2ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

    圖四 筆直均一的劃痕
     
    1.采集并分析圖像
    一般傷口愈合實(shí)驗(yàn)都是采集一張“劃痕”的初始圖像,再在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)候采集一張“劃痕”愈合的圖像。我們建議可以在這個(gè)過(guò)程多做幾個(gè)時(shí)間點(diǎn),這樣可以觀測(cè)到細(xì)胞遷移隨時(shí)間的變化特征。
    ● 在顯微鏡下選取能同時(shí)看到“劃痕”和兩邊細(xì)胞的視野進(jìn)行成像,“劃痕”的方向在視野內(nèi)為水平的或者垂直的。
    ● MCF-7細(xì)胞每半小時(shí)采集一張圖片,一直持續(xù)到20小時(shí)。
    ● 采用ibidi傷口愈合分析軟件,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的覆蓋面積,做出曲線圖,可以看到在大約11個(gè)小時(shí)的時(shí)候,細(xì)胞基本就已經(jīng)長(zhǎng)滿了,接下來(lái)幾個(gè)小時(shí)細(xì)胞覆蓋面積都不會(huì)發(fā)生變化(圖五)。

    圖五(a)  顯微鏡下觀察細(xì)胞覆蓋面積的變化

    圖五(b)  細(xì)胞覆蓋面積的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
     
     
    實(shí)驗(yàn)總結(jié)對(duì)比
    1.本實(shí)驗(yàn)方法能得到重復(fù)性更好的劃痕(圖六);

    圖六 通過(guò)計(jì)算劃痕的面積可以看出,在多次實(shí)驗(yàn)中,槍頭劃痕(左圖)
    制造的劃痕面積數(shù)據(jù)波動(dòng)大,重復(fù)性差;ibidi傷口愈合插件(右圖)制造的劃痕面積數(shù)據(jù)統(tǒng)一,重復(fù)性良好
     
     
    2.不會(huì)刮壞細(xì)胞,也不會(huì)造成劃痕的邊緣的細(xì)胞有機(jī)械損傷;
     
    3.不會(huì)傷害到培養(yǎng)皿底部的包被蛋白;

    圖一:左圖表示槍頭劃過(guò)后,底部包被蛋白被劃傷,細(xì)胞遷移結(jié)果受到底部不均一的影響。右圖ibidi插件移除后底部的包被蛋白沒(méi)有被破壞。
     
    4.通過(guò)計(jì)算細(xì)胞覆蓋面積得出細(xì)胞遷移結(jié)果,避免人為選取測(cè)量點(diǎn),使數(shù)據(jù)更客觀。1天內(nèi)就能得到測(cè)量結(jié)果,實(shí)驗(yàn)分析更快更準(zhǔn)確。

     

     

     

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